本课题来源于陕西省科技厅和中医药管理局3项基金资助。 α-亚麻酸(α-inolenic acid;ALA)作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要生理活性。国际医学和营养学界的大量基础研究、流行病学调查、动物试验及临床观察表明,ALA具有以下多方面的生理功效,即预防心脑血管病、抑制癌症的发生和转移、抑制过敏反应和抗炎作用、抑制衰老、增强智力和保护视力等功能。所以,ALA是重要的生物营养原料。鉴于国内、外ALA研究现状的分析,花椒籽即椒目(Bunge pricklyash seed;BPS)在陕西省仅韩城市每年就多达4000余吨,全国大于12万吨。BPS是花椒的废弃物,因此,从BPS中提取椒目仁油(Kernel-oil from bunge pricklyash seed;KO-BPS)和提纯高纯度ALA是废物利用、利国利民的致富科技。国内、外文献及查新均未见从BPS中提取高纯度ALA原料的报道。为寻求ALA等不饱和脂肪酸[主要是ALA和亚油酸(linoleic acid;LA)]新资源和探讨其对人体可能产生的抗血栓药理作用及特点,本课题主要进行了如下研究。 1实验目的 1.1优选BPS中提取KO-BPS生产工艺; 1.2探讨高纯度ALA纯化技术路线和方法; 1.3比较和研究KO-BPS、ALA的抗血栓活性。 2实验方法 2.1 KO-BPS的提取工艺研究 2.1.1压榨法提取KO-BPS的工艺采用压榨法从BPS中提取KO-BPS,测定出油率,采用HPLC法测定ALA含量。 2.1.2化学法提取KO-BPS的工艺研究采用化学法(根据ALA的极性使用不同极性的有机溶剂)从BPS中提取KO-BPS,测定出油率,采用HPLC法测定ALA含量。 2.1.3 SFE-C02法提取KO-BPS的工艺研究采用SFE-C02法从BPS中提取KO-BPS,测定出油率,HPLC法测定ALA的含量。 2.1.4三种提取工艺的比较与分析比较三种工艺的出油率,提取的KO-BPS中ALA含量;综合分析其工业化生产的可行性,选择最佳工艺。 2.2 KO-BPS提纯高纯度ALA根据ALA及KO-BPS的理化性质,采用各种提取手段,从KO-BPS中提纯ALA,使其含量达到95%以上。 2.2.1皂化酸解采用皂化酸解的方法,使ALA从甘油酯状态转化为游离态。 2.2.2梯度冷冻根据饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸在相同温度下溶解度不同的原理,采用梯度冷冻的方法逐步将大部分的饱和脂肪酸析出并分离。 2.2.3尿素包合根据桶状的尿素分子可以将饱和脂肪酸及部分单不饱和脂肪酸包合的原理,进一步分离去除饱和脂肪酸和部分单不饱和脂肪酸。 2.2.4硝酸银络合根据硝酸银分子能够和含有双键的分子络合,并且双键越多,络合能力越强,ALA为三烯酸,通过与硝酸银络合,达到分离纯化目的。 2.3 ALA抗血栓活性研究 2.3.1出、凝血时间的测定连续给小鼠灌胃不同剂量的ALA和1∶1混合不饱和脂肪酸(ALA/LA)10天,测定各组断尾后的出、凝血时间。 2.3.2 CP-AD诱发体内血栓形成试验小鼠连续灌胃不同剂量的ALA和1∶1混合不饱和脂肪酸(ALA/LA)10天,用CP-AD诱发小鼠体内血栓形成,观察各组肺动脉栓塞小鼠的存活率。 2.3.3 A-V BP血栓形成试验大鼠连续灌胃不同剂量的ALA和1∶1混合不饱和脂肪酸(ALA/LA)10天,复制A-V BP血栓模型,检测各组血栓湿重。 2.3.4体外比浊法测定血小板聚集试验大鼠连续灌胃不同剂量的ALA和1∶1混合不饱和脂肪酸(ALA/LA)10天后,采血,使用体外比浊法测定血小板聚集率。 3实验结果 3.1 BPS中提取KO-BPS的工艺综合分析比较从BPS中提取KO-BPS的三种工艺,考察出油率、ALA含量,所得油的色泽,澄明度等指标,分析其工业化生产的可行性,最终选用传统压榨法进行提取。 3.2高纯度ALA的提纯方法BPS经皂化酸解得游离的混合脂肪酸,依次经梯度冷冻、尿素包合及硝酸银络合,得高纯度ALA。经HPLC分析,以本文的方法得到的ALA含量高达95.6%以上。 3.3 ALA和KO-BPS的抗血栓活性50mg/kg,100mg/kg和250mg/kg高纯度ALA及混合不饱和脂肪酸(ALA/LA=1/1)给小鼠灌胃治疗10天,显著延长出、凝血时间(P0.01);明显降低CP-AD诱发性肺动脉栓塞小鼠的死亡率(P0.01)。35mg/kg,70mg/kg和175mg/kg高纯度ALA及混合不饱和脂肪酸给大鼠灌胃治疗10天,明显抑制血小板在A-V BP中丝线上的沉积(P0.01)和大鼠体外血小板聚集(P0.01)。 4研究结论 4.1 BPS是ALA新的木本油脂资源压榨技术是其较理想的工业化生产方法。油脂中ALA等不饱和脂肪酸的含量高达80%,对于进一步开发新型食用保健植物油,特别是精制ALA和LA等人体必需营养素和研制保健或治疗新药具有重要实际意义。 4.2冬化最佳工艺条件混合脂肪酸与乙醇等体积在-10℃下冬化24小时。采用该工艺条件重复试验证实,ALA的含量可提高到39.90%,出油率可达70%。 4.3尿素包合最佳工艺条件混合脂肪酸∶95%乙醇∶尿素=1∶2∶1,-12℃冷冻16h;采用该工艺条件重复试验证实,包合后的提取物中ALA的含量可达47.37%,收油率为59.92%。 4.4硝酸银络合是ALA含量提高的关键性步骤,经络合后ALA的含量可达90%以上,收油率为20.18%,并且硝酸银回收后可重复使用。 4.5创新点第一,首次从BPS中提纯高纯度ALA(含量达到98.6%);“椒目仁油提取高纯度α-亚麻酸方法及其药物应用”获中国发明专利(ZL200510096193.6)。第二,发现高纯度ALA和其混合不饱和脂肪酸均具有明显抗血小板聚集和溶栓药理作用,并具有一定量效关系。第三,当ALA/LA=1/1时,其抗血栓药理活性等效甚至优于同剂量高纯度的ALA。

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